En av de mest avgörande framgångsfaktorerna för alla PCR-analyser som designas för livsmedelssäkerhet är resultatens noggrannhet och tillförlitlighet. Detta innebär mycket mer än detektionssystemets specificitet. Det handlar om ”robusthet” dvs. förmågan att att stå emot förändringar under olika betingelser. Följ med oss i denna tredje del i vår artikelserie för PCR-analyser där vi diskuterar hur PCR-testen designas för robustheten.
Precision uppnås genom att utföra inklusivitets- och exklusivitetsstudier som detekterar det önskade målet och utesluter resten utan att kompromissa med detektionskänsligheten. Testningen bör valideras med flera tillverkningssatser av analyskomponenter för att säkerställa reproducerbarhet med materialförsörjningen. När mål-PCR-kemin har uppnåtts, utvecklas den vidare för att möta industrins praktiska krav.
Den mest utmanande aspekten för detektering av mikrobiella patogener i livsmedel är själva matrisen där kravet är att detektera 1 livsduglig organism per analytisk enhet (t.ex. från 25 g till 375 g). Ingen analysmetod är för närvarande kapabel till detta av sig själv utan det krävs ett anrikningsförfarande under vilket målorganismen växer till en detekterbar nivå. Det är absolut nödvändigt att utveckla en noggrann detekteringsmetod som måste fungera konsekvent på ett varierat utbud av matmatriser, av vilka några kan ha specifika anrikningskrav. Efterföljande procedurer krävs sedan för att överföra och förbereda det berikade provet för analys som uppnår detektionsgränsen (LOD) för den övergripande analysen.
En procedur för lysering av målceller i det anrikade provet krävs för att frigöra DNA som fungerar som mall för amplifiering i PCR-reaktionen. Dessa procedurer måste vara enkla och lätta att använda för att underlätta de höga testvolymerna i livsmedelstestlaboratorier. Komplexiteten och antalet potentiella variabler i livsmedelstestning kräver noggrann och sträng testning av PCR-kemin under utveckling och därefter. Den önskvärda LOD i livsmedelsmatriser verifieras genom spikestudier efter anrikning med kända nivåer av målceller.
Fältförsöksstudier med samverkande laboratorier och kunder ger möjlighet att bestämma ”verkliga” prestanda och användarvänlighet för den övergripande analysen för slutkonsumenten. Det är också viktigt att införliva så många kända fellägen i utvecklingen av en produkt som möjligt för att säkerställa att den övergripande prestandan försämras minimalt i händelse av avvikelser från rekommenderad procedur.
Avvikelserna sträcker sig mellan studier som undersöker fel under tillverkningsprocesser till vanliga kundfel. Dessa studier är viktiga för att bestämma effekterna av medfödda variabler som tillförsel av testkomponenter som kan påverka den totala produkten. Data från utvecklingsaktiviteter används för att utveckla och validera slutresultatet.
Ett väsentligt krav för marknaden för livsmedelstestning är att resultaten ska vara lätta att tolka och möjliggöra snabba beslut som kan fattas med förtroende. Detta uppnås genom utveckling av analysalgoritmer för att generera en definitiv utdata. En väl utformad screeningmetod måste införliva datatolkning i designprocessen. Testmetoder baserade på molekylärbiologi har stor specificitet men många andra variabler måste byggas in i varje steg av proceduren för att ge en robust och tillförlitlig analys.