PCR har idag blivit en vanlig analysteknik på många livsmedelslabb. Följ med på första delen i vår mini-artikelserie i fem delar där vi diskuterar tekniken bakom det världsledande BAX™ PCR-system.
De senaste årens stora framsteg inom molekylärtekniken har på många sätt revolutionerat patogendetektion inom livsmedelssäkerhet. Medan traditionella odlingsmetoder fortfarande fungerar som ”standardmetoder”, kan den nya generationens gentester att leverera samma känslighet, men enklare och på betydligt kortare tid.
Polymeraskedjereaktionen
Nukleinsyror är biopolymera makromolekyler som finns i alla levande celler i form av de dubbelsträngade deoxiribonukleinsyra (DNA) och ribonukleinsyra (RNA). De innehåller genetisk information s.k. gener som är unika för en viss typ av livsform.
Polymerase Chain Reaction (polymeraskedjereaktion) är en molekylärbiologisk analysteknik som kan genererar miljontals kopior av en riktad DNA-region inom några få timmar. Tack vare ”förstärkningen” eller amplifieringen av målet kan PCR-metoden användas för att detektera mycket små mängder av organismer i ett prov, inklusive specifika patogener som t.ex Listeria monocytogenes eller E. coli O157:H.
De grundläggande komponenterna i PCR inkluderar primers, DNA-polymeras, nukleotider, specifika buffrande joner och mål-DNA mall. Primers är korta fragment av DNA som är komplementära till specifika segment av mål-DNA.
Primers är designade för att rikta in sig på unika regioner av DNA, vilket ger PCR-tekniken dess höga specificitet. Reaktionen börjar med ”denatureringssteget” vid en förhöjd temperatur, vanligtvis 95˚C, vilket gör att den dubbelsträngad DNA-mallen blir separerade i två enskilda strängar. Detta följs av kylningen som tillåter bindningen av primers till dess komplementära region på de separerade DNA strängarna. Enzymet DNA polymeras börjar sedan ’förlängningen’ genom att fästa nära slutet av primern och börjar lägga till nukleotider som resulterar i PCR produkt som kallas en amplicon. Flera amplicon kopior skapas när de tre stegen upprepas ett visst antal cykler. Amplikonerna som produceras under PCR kan detekteras genom infärgning med ethidiumbromid eller fluorescerande färgämnen som SYBR Green. Detekteringen kan ske i slutet av reaktionen eller under reaktionen med hjälp av en specialiserad PCR-teknik som kallas Realtids-PCR.
Fördelarna med PCR
Jämfört med traditionella mikrobiologiska analysmetoder så har PCR-baserad patogendetektion fyra stora fördelar:
- Snabb upptäckt
Resultat erhålls inom 1–2 timmar jämfört med 3–5 dagar för traditionella metoder. - Hög känslighet
PCR kan detektera en enda kopia av DNA. - Hög specificitet och selektivitet
PCR-analyser kan utformas för att vara det mycket specifik och selektiv för arter och stammar. - Kvantifiering
Tillåter uppräkning av bakterier i prov.
Till skillnad från traditionella metoder är PCR oberoende av det fysiologiska tillståndet hos organismen. Metoden fungerar lika effektivitet även i de fall där odling av celler kan vara utmanande. Omvänt kan testet inte skilja levande från döda celler utan någon typ av provberedning. Vissa prover kan också innehålla material som stör analysen och resultat och lösningar på dessa utmaningar måste undersökas innan man sätter i gång med PCR.
PCR-system
BAX™ PCR-system har använts för industriella livsmedelstillämpningar i över 20 år och är idag det ledande PCR-systemet i ISO-17025-labb över hela världen. Varje ny generation av systemet har sett framsteg inom instrumentering, mjukvara, reagens och kapacitet som lett till förbättringar i robusthet, användarvänlighet och analystider. Dessa attribut har onekligen gjort BAX™ PCR-system till en föregångare inom snabba patogendetektionsmetoder.
Läs mer om BAX och PCR-tekniken vår artikelserie. Du är också välkommen att kontakta vår applikationsspecialist Frank Axelsson för att boka ett möte för att diskutera era analysbehov och frågor.