Polymerase Chain Reaction (PCR) har fått bred acceptans som ett verktyg för att upptäcka patogener inom livsmedelsindustrin, och metoden fortsätter att öka i popularitet. Två val inom PCR-teknik finns tillgängliga för industrin att välja mellan slutpunkts- och realtids-PCR. Läs vidare så berättar vi om skillnader och hur det fungerar. Detta är andra delen i vår artikelserie om PCR-tekniken.
Slutpunkts-PCR
I slutpunkts-PCR utformas primrar eller korta oligonukleotider för att flankera målsekvensen som amplifieras under PCR-reaktionen. Mängden PCR-produkt (amplikon) som produceras under PCR detekteras med användning av ett icke-specifikt dubbelsträngat DNA (dsDNA) bindande färgämne. Traditionellt visualiserades amplikonet med hjälp av agarosgelelektrofores. Men fluorescerande färgämnen som SYBR Green används nu för att mäta den ackumulerade PCR-produkten i slutet av PCR utan att behöva köra en gel och därmed hålla systemet stängt. Vanligtvis uppnås detta genom att utföra ett uppvärmningssteg under vilket det dubbelsträngade (ds)DNA:t lossnar och frigör det fluorescerande färgämnet och följaktligen resulterar i en minskning av den fluorescerande signalen. Mängden och temperaturen vid vilken den fluorescerande signalen ändras motsvarar styrkan och typen av PCR-produkt som genereras under PCR-händelsen.
Realtids-PCR
Jämfört med slutpunkts-PCR detekterar realtids-PCR den ökande mängden amplikon i realtid efter varje PCR-cykel genom att mäta fluorescenssignalen. Förändringarna i fluorescensintensitet med varje PCR-cykel övervakas i ett amplifieringsdiagram, från vilket cykeltröskeln (Ct) beräknas. Ct-värdet, även kallat korsningspunkten (Cp), är omvänt korrelerat till mängden DNA som finns i provet och används för att mäta mängden amplikon som produceras i realtid. Detta mått kan användas för absolut kvantifiering genom en
standardkurva eller relativ kvantifiering genom jämförelse med känd mängd av ett referensmål.
Den fluorescerande signalen i realtids-PCR genereras av en fluorescensmärkt,
målspecifik DNA-sond som ingår förutom PCR-primrarna. En quencher som finns i sonden undertrycker fluorescensen i frånvaro av målsekvensen, men frisätts när målet är närvarande. Realtids-PCR-analyser ger en möjlighet att multiplexera för att inkludera många mål i en enda analys. Prober för olika mål är designade med reporterfärgämnen som avger fluorescens vid olika emissionsvåglängder. Tillsammans med en unik uppsättning primrar avger amplikoner som genereras för varje mål en unik fluorescerande signal. Fördelarna med Realtids-PCR är extra specificitet på grund av sonden och förmågan att multiplexa. Dessa fördelar bör emellertid vägas mot komplexiteten i sonddesign och kostnaden för sonden, som är dyr på grund av det fluorescerande reporterfärgämnet och quenchern. Å andra sidan ger slutpunkts-PCR ett billigare PCR-alternativ och enklare design med mer beroende av primrarna för specificitet.
Sammanfattning
Oavsett vilken PCR-teknik som väljs ligger nyckeln till framgången för en PCR-analys i livsmedelstestning i dess design och dess validering. För en slutpunktsanalys bör primrarna utformas noggrant för att vara selektiva för målet och för att uppfylla kriterier för inkludering/exklusivitet. För en realtids-PCR-analys, förutom primrarna, är utformningen av sonden avgörande för analysens selektivitet. För båda analyserna görs initial primers/probdesign med hjälp av bioinformatik, följt av våta laboratorietester med bakteriestammar för att bekräfta specificitet och selektivitet. För att uppnå robusthet är det dessutom absolut nödvändigt att optimera mängder av andra kritiska PCR-komponenter inklusive DNA-polymeras, nukleotider och salter. Tillägget av en intern positiv kontroll som en indikator på analysprestanda ger ökad tillförlitlighet och förtroende för resultaten. Slutligen är det viktigt att validera prestandan hos PCR-kemin på ett brett spektrum av lämpliga matriser för att säkerställa framgången för analysen och övervaka livsmedelssäkerheten!